До недавнего времени методика редактирования генов CRISPR/Cas9 могла быть использована только для манипуляций с ДНК. В исследовании, проведённом в 2016 году, учёные из медицинской школы (School of Medicine) Калифорнийского Университета в Сан-Диего (University of California San Diego) перепрофилировали метод отслеживания РНК в живых клетках в методе, называемом РНК-нацеливанием Cas9 (RCas9).
В новом исследовании, опубликованном 10 августа в журнале Cell, команда продвигает RCas9 на ещё один шаг. Теперь учёные использовали этот метод для исправления молекулярных ошибок, которые приводят к заболеваниям с повторным расширением микросателлита, например, миотонической дистрофии первого и второго типа и болезни Хантингтона.
«Это интересно, потому что мы не только нацелены на основную причину заболеваний, для которых в настоящее время не существует методов лечения для замедления прогрессирования. Мы также переработали систему CRISPR/Cas9 таким образом, чтобы было возможно доставить её в определённые ткани при помощи вирусного вектора», — сказал старший автор Джин Йе, доктор философии, профессор клеточной и молекулярной медицины (Gene Yeo, PhD, professor of cellular and molecular medicine) в Калифорнийской медицинской школе Сан-Диего.
Если ДНК похожа на проект архитектора для клетки, РНК — это интерпретация проекта инженером. В основе жизни на Земле лежит следующий механизм: гены, закодированные в ДНК в ядре, транскрибируются в РНК, а РНК переносят сообщение в цитоплазму, где они транслируются для создания белков.
Заболевания экспансии некодирующих (микросателлитных) повторов возникают из-за ошибочных повторов в последовательностях РНК. Они токсичны для клетки, отчасти потому, что они мешают образованию важнейших белков. Эти повторяющиеся РНК накапливаются в ядре или цитоплазме клеток, образуя плотные узлы, называемые фокусами.
В этом исследовании, которое доказывало концепцию, команда Йе использовала RCas9 для устранения проблемных РНК, связанных с болезнями экспансии некодирующих повторов в клетках пациентов, и в клеточных моделях заболеваний в лаборатории.
Обычно CRISPR/Cas9 работает следующим образом: исследователи разрабатывают «направляющую» РНК, чтобы соответствовать последовательности определённого гена-мишени. Затем РНК направляет фермент Cas9 в нужное место в геноме, где он «режет» ДНК. Клетка неточно восстанавливает разрыв ДНК, таким образом, деактивируя ген. В ином случае, исследователи заменяют участок, прилегающий к разрезу, скорректированной версией гена. RCas9 работает аналогично, но в рамках этой технологии РНК направляет Cas9 в молекулу РНК вместо ДНК.
Исследователи протестировали новую систему RCas9 в лаборатории. RCas9 устранила 95% или более очагов РНК, связанных с миотонической дистрофией 1 и 2 типа, одним типом бокового амиотрофического склероза и болезнью Хантингтона. Этот подход также устранил 95% аберрантных повторяющихся РНК в клетках пациента с миотонической дистрофией, культивированных в лаборатории.
Ещё одно открытие, сделанное в ходе исследования, было связано с MBNL1. Это белок, который обычно связывает РНК, но отделяется от своих РНК-мишеней фокусами РНК при миотонической дистрофии 1 типа. Когда исследователи применяли RCas9, они реверсировали 93% этих дисфункциональных РНК-мишеней в мышечных клетках пациента, и клетки в конечном счёте стали напоминать здоровые контрольные клетки.
«Хотя это исследование даёт первые доказательства того, что подход работает в лаборатории, прежде чем RCas9 можно будет испытать у пациентов, предстоит пройти долгий путь», — объяснил Йе.
«Главное, чего мы ещё не знаем, заключается в том, будут ли вирусные векторы, которые доставляют RCas9 в клетки, будут лишены иммунного ответа, — сказал он. — Прежде чем это можно было бы проверить на людях, нам нужно протестировать его на животных моделях, определить потенциальную токсичность и оценить долгосрочное воздействие».
Для этого Йе и его коллеги запустили специализированную компанию под названием Locana. Она предназначена для обработки доклинических шагов, необходимых для перемещения RCas9 из лаборатории в клинику для лечения заболеваний, связанных с нарушениями РНК.
«Мы очень взволнованы по поводу этой работы, потому что мы не только определили новый потенциальный терапевтический механизм для CRISPR-Cas9, но и продемонстрировали, как его можно использовать для лечения целого класса заболеваний, для которых нет успешных вариантов лечения», — сказал Дэвид Неллес (David Nelles), соавтор первого исследования исследования с Ранджаном Батрой (Ranjan Batra), другим исследователем из лаборатории Йе.
«Существует более 20 генетических заболеваний, вызываемых микросателлитными экспансиями в разных местах генома, — сказал Батра. — Возможность программировать систему RCas9 для нацеливания на разные повторы в сочетании с низким риском побочных эффектов — вот главная сила [нашей разработки]».
