Мыши-модели часто используются для доклинического моделирования человеческих заболеваний, однако лекарства, успешно испытанные на мышах, признаются годными для людей примерно в одном случае из десяти. Почему? Ответить на этот вопрос помогает новое исследование, в котором проведено сравнение экспрессии генов в клетках головного мозга человека и мыши.
Есть ли в научной литературе что-то такое, из-за чего у многих исследователей, в частности медиков, сносит крышу? Пожалуй, есть, и это — неуёмное расхваливание как локомотива научного прогресса доклинических исследований, проводимых на клеточных культурах и животных-моделях, причём эти исследования хвалят даже тогда, когда изучаемый в ходе их проведения способ лечения ещё не преобразован в способ лечения людей. Не поймите меня неправильно; иногда и исследование мышей приводит к важному прорыву в медицине. Однако гораздо чаще встречается другое: методы лечения, эффективные для мыши, нельзя перенести на человека, поскольку они вообще не лечат людей или лечат очень плохо. Мой любимый пример — ингибиторы ангиогенеза, изучавшиеся мною в начале моей научной карьеры. Ещё в конце 90-х годов ХХ века ангиостатин и другие ингибиторы ангиогенеза — препараты, способные предотвращать образование новых кровеносных сосудов в опухоли, — рекламировались как лекарство от рака. Дело в том, что развитие рака, по меньшей мере тех его видов, которые наиболее опасны, зависит от его способности вынуждать организм генерировать для непрерывного роста опухоли новые кровеносные сосуды диаметром свыше двух миллиметров, чтобы удовлетворять её ненасытную потребность в кислороде и питательных веществах. К тому же, были получены впечатляющие результаты на мышах. Мой замечательный наставник, ныне покойный великий Джуда Фолкман (Judah Folkman) успешно вылечивал их от рака. Он мог даже вызывать у них «спячку» опухоли — такое её состояние, когда она, уменьшившись до крошечного размера, неопределённо долго остаётся совершенно бездействующей. И всё это с помощью ангиостатина и эндостатина — двух ингибиторов эндогенного ангиогенеза, которые были выделены им из мочи и крови мышей. К сожалению, при лечении рака у людей ингибиторы ангиогенеза хоть и работают, но весьма слабо, не давая быстрого впечатляющего эффекта, в силу чего их используют наряду со многими другими препаратами с целью постепенно улучшить состояние больного. В то время в ходу у доктора Фолкмана была язвительная шутка: «Если у вас рак и вы мышь, мы непременно вам поможем».
Так в чём же дело? Почему многие препараты, которые успешно лечат мышей, неэффективны при лечении людей? Взять, к примеру, нейропсихиатрию: здесь попытки предсказывать эффективность новых методов лечения людей на основе данных, полученных с помощью мышей-моделей, оказались особенно плачевными. Чтобы получить ответ на интересующий нас вопрос, обратимся к результатам недавно опубликованного исследования, показавшего, что одной из причин указанной неэффективности, по крайней мере при создании препаратов, предназначенных для лечения психических и неврологических расстройств, является не учитывавшаяся ранее разница в функционировании головного мозга. Прежде чем провести анализ данной научной работы, позвольте предоставить слово Шэрон Бегли (Sharon Begley), написавшей о ней для STAT News:
«Во имя науки лабораторным мышам приходится очень много страдать, но часто это компенсируется, пусть и ненадолго, открытием эффективных, почти чудодейственных средств лечения убивающих людей болезней. К сожалению, экспериментальные препараты против болезни Альцгеймера, шизофрении и глиобластомы, вылечившие миллионы мышей, не вылечили ни одного человека, и этот печальный факт говорит о том, что, когда нужно заменять людей при тестировании новых средств лечения многих заболеваний головного мозга, мыши являются весьма паршивыми моделями.
Согласно опубликованному в среду сообщению, учёным удалось установить главную причину разного воздействия лекарственных препаратов на мышь и человека: в человеческом кортексе содержатся виды клеток, отсутствующие в кортексе мышей, и, что особенно важно, активность ключевых генов этих человеческих клеток существенно отличается от активности ключевых генов мышиных клеток.
В рамках самой подробной на сегодняшний день классификации клеток человеческого головного мозга, проведённой командой учёных размером с симфонический оркестр, клетки мозга сортируются не по их форме и локации, как было принято на протяжении десятилетий, а по тому, какие гены они используют. Попутно сделаны важные открытия, и среди них такое: нейроны мыши и человека, которые при стандартных формах классификации считались одинаковыми, могут существенно (в десять и более раз) различаться по экспрессии генов для таких ключевых компонентов головного мозга, как рецепторы нейромедиаторов».
Я не знаю, была ли команда учёных и в самом деле «размером с симфонический оркестр» (по моим подсчётам, в неё входило примерно 63 специалиста плюс-минус два), но для такого рода исследований действительно требуется большой научный коллектив, составленный из представителей нескольких университетов, таких как Калифорнийский университет в Дейвисе (University of California, Davis), Вашингтонский университет (University of Washington), Колумбийский университет (Columbia University), Калифорнийский университет в Сан-Диего (University of California, San Diego), а также целого ряда институтов. Впрочем, как можно понять из приведённой цитаты, главное не это, а то, что у мышей и людей нейроны и цепи, соединяющие различные области головного мозга, даже имея поразительное анатомическое сходство, на уровне экспрессии генов могут оказаться очень разными.
А как работали исследователи-классификаторы? Прежде всего, они провели сбор биологического материала: во-первых, контрольного материала — головного мозга умерших доноров мужского и женского пола в возрасте 18 — 68 лет, у которых не было нейропсихиатрических или неврологических заболеваний, а во-вторых — тканей головного мозга пациентов, перенёсших операцию по поводу эпилепсии. Во всём этом материале наибольший научный интерес представляла средняя височная извилина (MTG) — часть кортекса, которая нередко подвергается резекции при лечении эпилепсии, а потому позволяет сравнивать контрольный материал с материалом, взятым у эпилептиков. Затем исследователи осуществили секвенирование одиночных ядер собранных образцов:
«Молекулярная классификация типов клеток стала возможной благодаря транскриптомике одиночных клеток, которая обеспечивает метрику для сравнительного анализа и стимулирует усилия, направленные на выявление полного клеточного состава мышиного головного мозга и даже всего человеческого тела. Секвенирование РНК одиночных клеток (scRNA-seq) мышиного кортекса демонстрирует надёжные транскрипционные сигнатуры типов клеток и говорит о наличии в коре головного мозга около 100 типов клеток. Сложность извлечения из головного мозга человека живых клеток затрудняет применение к данному типу ткани scRNA-seq. Другое дело — секвенирование РНК одиночных ядер (snRNA-seq), которое позволяет проводить транскрипционное профилирование клеточных ядер, содержащихся в замороженных образцах человеческого мозга. Следует отметить, что имеющейся в ядрах информации об экспрессии генов вполне достаточно для различения близкородственных типов клеток с примерно таким же высоким разрешением, какое даёт scRNA-seq, однако глубины охвата, применявшейся в ходе ранних попыток исследовать человеческий кортекс с помощью snRNA-seq, не хватило для того, чтобы разрешение оказалось аналогичным тому, какое получено при работе с мышами. И вот теперь мы создали надёжные методы для классификации типов клеток человеческого головного мозга с использованием snRNA-seq и провели сравнение типов кортикальных клеток человека и мыши для выявления консервативных (сходных) и дивергентных (расходящихся) свойств».
Чтобы минимизировать усилия, лучше всего было бы секвенировать геном одиночных клеток, но, по-видимому, извлечение отдельных клеток из головного мозга без их умерщвления — большая техническая проблема; поэтому авторы использовали другой отличный метод: секвенирование одиночных ядер. Его недостатком является то, что ядро не содержит всей создаваемой матричной РНК (мРНК), ибо для трансляции (синтеза белков) мРНК транспортируется за пределы ядра. Однако в данном случае, как показали более ранние исследования, секвенирование одиночных ядер позволяет выявлять различия в экспрессии генов между разными типами клеток головного мозга не хуже, чем секвенирование одиночных клеток. А вообще RNA-Seq — это метод секвенирования нового поколения, сделавший доступным секвенирование каждой последовательности мРНК из тех, что можно обнаружить в каком-либо изоляте РНК из клеток или ткани; в настоящее время метод получил такое развитие, что позволяет осуществлять секвенирование на изолятах РНК одиночных клеток и ядер.
Теперь рассмотрим масштаб проведённого классификаторами исследования. Ядра были выделены из восьми донорских мозгов, причём большая часть поступила от посмертных доноров (n = 15 206), а меньшая (n = 722) — от эпилептиков (фрагменты пятого слоя MTG, удалённые во время нейрохирургических процедур):
«В общей сложности контроль качества прошли 15 928 ядер: из возбуждающих нейронов — 10 708, из тормозящих нейронов — 4 297 и из клеток, не являющихся нейронами, — 923. Ядра из каждого широкого класса клеток были итеративно кластеризованы, как описано ниже (см. «Методы»). Кластеры, как правило, сохраняли устойчивость при использовании различных методов итеративной кластеризации, их отличие от ближайших соседей составило, как минимум, тридцать дифференциально экспрессированных генов и, как минимум, один (а нередко и более) двоичный маркер».
Перевод: проведя секвенирование, исследователи отметили, что различные типы клеток могут быть надёжно идентифицированы с помощью различных методов математической кластеризации, используемых для анализа данных геномики.
Цель проведённого исследования состояла в том, чтобы разработать и проверить методы и систему применения snRNA-Seq для каталогизации типов клеток MTG, а позже и других частей головного мозга. Поэтому, если ты не невролог или нейробиолог, все задокументированные особенности типов клеток и их локации разбирать ни к чему. Впрочем, ряд сделанных наблюдений нужно отметить. Например, такое: возбуждающие нейроны оказались распределёнными гораздо шире, чем ожидалось, при этом большинство типов этих нейронов локализовано не в пределах одного какого-то слоя. В слоях L2 и L3 в основном представлены три типа, тогда как в слоях в L3 — L6 — целых десять. Такая неоднородность, отметили авторы исследования, «заставляет сделать вывод, что для определения типа нейрона недостаточно установить его анатомическую ламинарную локацию, но характерно ли это для всего человеческого кортекса или только для MTG, пока неясно».
Когда исследователи сравнили эти профили генной экспрессии человеческих одиночных ядер с аналогичными профилями мышиных одиночных клеток в той же области головного мозга, они отметили несколько различий. Установлено, что нейроны мышей и людей, которые на основе анатомических, структурных и гистологических признаков, а также в соответствии со стандартными схемами классификации было принято считать одинаковыми, на самом деле могут иметь десятикратную и даже большую разницу в экспрессии генов для синтеза очень важных белков, таких как рецепторы нейромедиаторов. (Нейромедиаторы — это пептиды, применяемые нейронами для коммуникации друг с другом). Например:
«Сравнение гомологичных типов показало смесь консервативной и дивергентной экспрессии. Тип Sst Chodl (у человека — Inh L3-L6 SST NPY) в целом демонстрирует консервативную экспрессию, но у 18% генов экспрессия оказалась высоко дивергентной (здесь применялся консервативный подход к пониманию дивергентности: разница должна быть более чем десятикратной), в том числе и у многих маркерных генов. У клеток-предшественниц олигодендроцитов (OPCs) картина аналогичная: в целом консервативная экспрессия и 14% генов с высокой дивергентностью экспрессии. У двух третей подвергшихся анализу генов (9748) отмечена дивергентная экспрессия по меньшей мере в одном из 37 гомологичных типов, а у многих наблюдались изменения экспрессии в пределах одного типа или класса. Типы клеток, не являющихся нейронами, показали наиболее дивергентную экспрессию (3643 гена с более чем десятикратной разницей), что говорит в пользу повышенной эволюционной дивергенции ненейронных паттернов экспрессии человеческого и мышиного организмов».
Перевод: при сравнении мышиных и человеческих генов почти 20% генов показали очень разную экспрессию (более чем десятикратная разница) и по меньшей мере две трети генов — разную. Наиболее заметной эта разница оказалась у гена, кодирующего рецепторы серотонина:
«Серотониновые рецепторы демонстрируют высоко дивергентную экспрессию для двух исследованных видов: четыре из семи рецепторов, сопряжённых с G-белком, и обе субъединицы ионотропных рецепторов (HTR3A и HTR3B) вошли в число 10% наиболее дивергентных генов (рис. 6e). Наиболее дивергентные семейства генов включают в себя рецепторы нейромедиаторов, ионные каналы, элементы внеклеточного матрикса и молекулы клеточной адгезии. Из топовых 3% наиболее дивергентных генов (дополнительная таблица 5) коллагены COL24A1 и COL12A1 и субъединицы рецептора глутамата GRIK1 и GRIN3A были экспрессированы в разных типах клеток двух видов, и было подтверждено, что они имеют разные ламинарные распределения у человека и мыши (рис. 6f, g). Кумулятивный эффект, порождаемый множеством различий в клеточных генных паттернах с хорошо охарактеризованными ролями при передаче нейронных сигналов и обеспечении нейронной связности, безусловно, не может не вызывать множество различий в функционировании кортикальной цепи человека».
Серотонин (5-гидрокситриптамин, или 5-НТ), как известно, — это молекула с множеством функций, осуществляемых в разных частях тела. В частности, серотонин может функционировать как гормон, фактор роста или нейромедиатор. Например, он накапливается в тромбоцитах, которые высвобождают его при связывании с тромбом, и, когда концентрация серотонина высока, он вызывает сужение кровеносных сосудов. (Интересно отметить, что при низких концентрациях он выступает как сосудорасширяющее средство). Кроме того, серотонин способствует заживлению ран. Однако в головном мозге он, прежде всего, нейромедиатор, влияющий, как полагают учёные, на настроение, половую активность, аппетит, сон, память, способность учиться, регулирование температуры и некоторые формы социального поведения. Наибольшую известность (по крайней мере, среди широкой общественности) серотонин получил как один из факторов депрессии — благодаря целому классу препаратов, которые называются селективными ингибиторами обратного захвата серотонина (СИОЗС) и используются для лечения социальной фобии, тревожных и панических расстройств, обсессивно-компульсивных расстройств (ОКР), большой депрессии, синдрома раздражённого кишечника (СРК) и нарушений пищевого поведения.
Как правило, при коммуникации двух нейронов один из них выпускает в пространство между ними (синапс) определённые нейромедиаторы, такие как серотонин. Нейромедиатор диффундирует от данного (пресинаптического) нейрона через синапс к постсинаптическому нейрону и связывается с его рецептором, активируя тем самым в постсинаптическом нейроне сигнал. После того как сигнал отправлен, нейроны, используя белки-транспортёры, избавляются от наличия в синапсе дополнительного нейромедиатора. Как только нейромедиатор, связавшийся с рецептором, высвободился, белки-транспортёры снова переносят его в клетку. СИОЗС ингибируют эту активность специфических переносчиков серотонина, что позволяет тому, задерживаясь в синапсе, дольше стимулировать рецептор постсинаптического нейрона.
В связи с данным обстоятельством авторы исследования в ходе обсуждения полученных результатов отмечают:
«Наши результаты демонстрируют дивергенцию экспрессии генов исследованных видов в гомологичных типах клеток, что показано как на уровне одиночных генов, так и на уровне структуры в целом. Эти различия, вероятно, являются функционально значимыми, поскольку дивергентные гены участвуют в связывании нейронов и в передаче сигналов и поскольку многие маркеры типов клеток демонстрируют дивергентную экспрессию. Примечательно, что серотониновые рецепторы занимают второе место среди наиболее дивергентных генных семейств, что затрудняет использование мышей-моделей для исследования многих психоневрологических расстройств, связанных с серотониновой сигнализацией».
И в заключение:
«Эти наблюдения задают количественные рамки для дискуссии о том, отличается ли кора человека от коры других млекопитающих, выявляя базисное транскриптомное сходство типов клеток, нарушаемое способными влиять на функционирование микроцепи различиями в пропорциях и экспрессии генов у разных видов. Кроме того, полученные результаты помогают разрешить парадокс неудачного использования мышей для доклинических исследований, несмотря на наличие у млекопитающих консервативной генной структуры, и подчёркивают необходимость дополнять анализ головного мозга модельных организмов анализом человеческого мозга. Масштабы различий между человеком и мышью таковы, что для изучения многих аспектов структуры и функций человеческого головного мозга следует провести аналогичное профилирование мозга гораздо более близких к человеку нечеловекообразных приматов. Кроме того, большие перспективы для ускорения механистического понимания эволюции мозга и его болезней открывает улучшенное разрешение, ставшее возможным благодаря молекулярным технологиям».
А вот мнение ведущего исследователя Эда Лейна (Ed Lein) из Института Аллена по изучению мозга (Allen Institute for Brain Science) в Сиэтле, опубликованное в STAT News:
«„Все создаваемые лекарственные препараты воздействуют на рецепторы или другие молекулы, — сказал нейробиолог Эд Лейн из Института Аллена по изучению мозга в Сиэтле, возглавлявший исследование, результаты которого опубликованы в журнале Nature. — Если в человеческих клетках, в отличие от аналогичных мышиных, тот рецептор нейромедиатора, на который вы надеетесь нацелиться, не используется, то ваше лекарство попадёт в неправильную цепь“. Стало быть, оно не сможет так же подействовать на людей, как действовало на лабораторных грызунов».
Итак, хотя головной мозг мыши и человека имеет базисные черты сходства, данное исследование неожиданно показало, что в модели, представляющей собой мышиную версию структур человеческого мозга, нейроны используют различные рецепторы нейромедиаторов существенно иначе, чем в оригинале. Результаты этого исследования помогут учёным лучше интерпретировать результаты исследований, проводимых на мышах, и, будем надеяться, аккуратнее применять их по отношению к нейрофизиологии человека. А тем временем, узнав о каком-то исследовании, проверьте, не проводилось ли оно только на мышах. В Твиттере есть даже фид @justsaysinmice, основная цель которого — обратить внимание на широко разрекламированные исследования такого рода.
И пока мы ждём, что исследования на животных моделях станут более предсказуемыми в плане применимости их результатов к человеку, за @justsaysinmice имеет смысл следить.
