На протяжении десятилетий визуализацию клеток и тканей для цифровой патологии, исследований рака и головного мозга обеспечивала оптическая микроскопия. Образцы обычно изучаются в замороженных срезах. В большинстве из этих систем для зондирования образца используются конфокальная микроскопия и однофотонное возбуждение, обычно от источника света с непрерывной волной. Многофотонная микроскопия применяется при визуализации ткани в её естественной среде, когда требуются глубокое проникновение в ткань и разрешение клеточного уровня. В лазерных сканирующих многофотонных микроскопах свет от сверхбыстрого лазера жёстко фокусируется и сканируется по образцу с помощью быстрых зеркал. Изображение создаётся путём определения интенсивности сигнала флуоресценции в каждой точке и пространственного отображения с помощью компьютерного программного обеспечения.
Источник возбуждения и реализация обнаружения сигнала имеют решающее значение для биологической визуализации, простоты использования и времени безотказной работы прибора. Многофотонная микроскопия использует высокофокусированный лазерный луч в ближнем инфракрасном диапазоне (NIR), обычно между 780 и 1300 нм, для получения нелинейных оптических эффектов, основанных на взаимодействии нескольких фотонов, одновременно поступающих на молекулу. Следовательно, с ростом количества облучивших молекулу фотонов интенсивность генерируемого сигнала увеличивается не линейно, а возводится в квадрат (для двухфотонных эффектов) или в третью степень (для трёхфотонных). Это явление ограничено очень плотным объёмом, сосредоточенным в плоскости фокуса, что значительно уменьшает сечение поглощения от окружающего материала. Более того, использование длин волн в диапазоне NIR приводит к меньшему рассеянию в ткани и обеспечивает более высокую глубину проникновения по сравнению с обычными линейными конфокальными методами. Это позволяет проводить 3D-срезы с меньшими фотообесцвечиванием и фототоксичностью, которые мешают однофотонным методам.
Возможны измерения в реальном времени и с длительной экспозицией — например, в экспериментах по изучению живых животных и взаимодействия таргетных лекарственных средств с мишенями. Один из ярких примеров использования лазерной сканирующей многофотонной микроскопии — визуализация в глубине живого головного мозга животных (Рисунок 1d) с использованием стандартных маркеров, таких как GCaMP.
Большая глубина проникновения в сочетании с меньшим фотоповреждением — основные преимущества использования лазерной сканирующей многофотонной микроскопии для живых или фиксированных нативных объёмных образцов, таких как головной мозг, эмбрионы, живые органы или животные, или для выращенных in vitro сфероидов или органоидов.
Поиск универсальных решений
По мере роста числа практических приложений многофотонной микроскопии растёт и спрос на простой в использовании, переносимый и мультимодальный инструмент, который можно адаптировать к любому рабочему пространству в помещении. Идеальная система должна выдавать высококачественные результаты и быстро обрабатывать большие объёмы данных, обеспечивая при этом мощный рабочий процесс, экономящий время. Кроме того, возможность выполнять мультимодальный анализ в одной и той же области интереса без неудобств, связанных с перемещением образца в другую систему, максимизирует содержание и обеспечивает более мощную дополнительную информацию.
Прочные и готовые к использованию в промышленности устройства, которые могут использоваться для клинических исследований и способны работать в любых помещениях, вероятно, представляют собой будущее лазерной сканирующей многофотонной микроскопии. Коммерчески доступным системам не хватает гибкости и мобильности для использования за пределами лаборатории. Сканирующая головка (включая оптику с направленным лучом) и наличие сверхбыстрого лазерного источника имеют решающее значение для общей функциональности и удобства использования микроскопа. В большинстве систем эти два компонента разделены, и обычно они производятся разными поставщиками.
Промышленным стандартом для фемтосекундной лазерной системы уже почти 40 лет служит титан-сапфировая лазерная технология (Ti:sapphire). Эти системы хрупкие, требуют большого оптического стола, подачи воды для охлаждения и специальной инфраструктуры. Они очень сложны, весьма небезопасны, и для их эксплуатации, как правило, нужны квалифицированные специалисты. Их размер и вес, а также количество потребляемой ими энергии делают их непригодными для большинства клиник, и, кроме того, их невозможно транспортировать. Клиническим исследователям нужен портативный мультимодальный микроскоп «под ключ», который можно установить в любом помещении и которым сможет пользоваться большинство сотрудников.
Приборы нового поколения
Конструкция сверхгибкого лазерного сканирующего многофотонного микроскопа для получения изображений in vivo основана на очень гибком интерфейсе и лазерном дизайне. Способность легко маневрировать сканирующей головкой — секрет адаптации к работе с широким спектром объектов, от слайдов до живых мышей. Конструкция сканирующей головки имеет решающее значение для того, чтобы микроскоп можно было использовать в практически любом эксперименте. Микроскоп должен иметь гальвано-резонансные сканеры, фотоумножительные трубки, объективы, широкоугольную камеру и подсветку, полную оптику для сканирования и лазеры — всё в одном компактном, готовом к работе модульном форм-факторе (Рисунок 1) [1].
Мощность и размер лазерного источника имеют решающее значение при создании действительно портативного и гибкого лазерного сканирующего многофотонного микроскопа. Волоконные лазеры хорошо подходят для этой цели, поскольку они компактны, прочны и энергоэффективны практически для любого внутреннего рабочего пространства. Они имеют воздушное охлаждение и не требуют технического обслуживания, поэтому нет необходимости в подаче охлаждённой воды или сервисном обслуживании. Например, микроскоп серии MPX, недавно разработанный Prospective Instruments, оснащён двухволновым фемтосекундным волоконным лазером с длиной волны 1040 нм с фиксированной выходной мощностью (>500 мВт) и вторым широко настраиваемым лазером в диапазоне от 750 до 960 нм и от 1150 до 1300 нм (>200 мВт). Длительность импульса составляет <140 фс при работе с частотой повторения 80 МГц. Все эти параметры замерены во взаимодействии с образцами и достаточны для сечения >1 мм.
Многофотонная визуализация с высоким разрешением была продемонстрирована на животных, включая рыбку данио и плодовую мушку (дрозофилу). В обоих случаях получена бесценная информация для понимания и упреждения патофизиологии человека. В недавних экспериментах как сигналы возбуждения (130 фс при 1040 нм), так и сигналы обнаружения отображались через 20-кратный водно-иммерсионный объектив (NA 1.0).
Фиксированные образцы дрозофил были иммуногистохимически (IHC) окрашены флуорофорами (Hoechst и Alexa-Fluor 488), тогда как живые личинки рыбок данио экспрессировали белки, помеченные флуорофором (зелёный флуоресцентный белок, или GFP, и mCherry).
Структурные и функциональные детали наблюдались при комплементарной двухфотонной визуализации и генерации второй гармоники (SHG) (Рисунок 2) с использованием z-стека и наложенных изображений живой рыбки данио, демонстрирующих дифференцированные особенности, такие как работающее сердце. Другой пример, на Рисунке 3, показывает особенности мышцы (z-полосы) и мигрирующей клетки с наложением двух модальностей. SHG — это метод без меток для выделения коллагена и мышц из окружающей среды. Контраст цветов повышает специфичность изображения, что необходимо для понимания взаимосвязи между здоровой, повреждённой и больной тканью или между различными типами клеток и компонентами внеклеточного матрикса.
Визуализация рыбок данио
В течение долгого времени бесценным объектом в области метаболической патологии, биологии развития и неврологии служила рыбка данио. Её статус позвоночного, а также способность откладывать большое количество легко собираемых прозрачных яиц и её устойчивая транспарентность на стадии личинки делают её очень практичной и целесообразной живой моделью для исследований. Генотип рыбки данио демонстрирует около 70% гомологии с генами человека и высокую чувствительность к фармакологическим и генетическим манипуляциям [2], что позволяет данио служить моделью для понимания различных неврологических расстройств, таких как болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера и эпилепсия, а также психических расстройств, включая синдром дефицита внимания с гиперактивностью и шизофрению.
Визуализация мозга рыбки данио не отражает всей психосоциальной сложности человеческого мозга, поскольку система неврологических цепей этой рыбы содержит меньше нейронов и области мозга организованы линейно. Но оптимальная прозрачность мозга данио позволяет максимально чётко запечатлеть весь его объём на одном изображении. Как показано на Рисунке 3, использование многофотонной визуализации усиливает эти характеристики, поскольку сниженная фототоксичность предоставляет возможность вживую визуализировать рыбку данио от её нейронной сети до её субсинаптических компонентов [3].
Это особенно полезно для визуализации сетчатки. Рыбка данио имеет сетчатку, подобную сетчатке позвоночных, со сложной и самодостаточной сетью нейронных популяций. В целом, в этой сетчатке пять различных типов нейронов: фоторецепторы, биполярные клетки, ганглиозные клетки сетчатки, амакриновые клетки и горизонтальные клетки. Ганглиозные клетки — единственные, которые запускают потенциалы действия, в то время как фоторецепторы — единственные нейроны, которые непосредственно реагируют на свет. Существует также два типа фоторецепторов, называемых палочками и колбочками. Палочки большие, цилиндрические и гораздо более чувствительны к свету. Колбочки короче и отвечают исключительно за цветовое зрение. Колбочки имеют подтипы, содержащие фотопигменты, чувствительные к различным длинам волн. Использование генетических методов с помощью современных многофотонных микроскопов может улучшить наше понимание развития сетчатки, её морфологии и таких заболеваний, как дегенерация жёлтого пятна [4].
В упомянутых исследованиях рыбок данио живые личинки для иммобилизации образцов были обработаны трикаином. Затем их помещали в 35-миллиметровую чашку Петри с 0,8-процентной агарозой. Когда агарозу полимеризовали, личинок покрывали средой 0,5×E2 и получали изображение. Трёхмерная визуализация ближнего поля (Рисунок 4) позволяет детально визуализировать нейроны в глазу в передней части тела. Использование настройки увеличения в дальнем поле позволяет визуализировать нейроны, идущие вдоль боковой линии. Также можно использовать настройку ближнего поля для создания изображения сетчатки и её нейронов с высоким разрешением. Поскольку живые образцы рыбок данио, экспрессирующие белки, помеченные флуорофором, дают интенсивный и надёжный сигнал флуоресценции, это помогает уменьшить фотообесцвечивание. Замедленные мигрирующие клетки визуализировали с помощью филоподий в течение длительного времени. Кроме того, эти изменения в увеличении позволяют комбинировать и анимировать несколько изображений, обеспечивая дополнительную визуализацию рыбьей мускулатуры и сосудистой сети, которую невозможно получить с помощью традиционного конфокального микроскопа.
Визуализация мозга дрозофилы
Drosophila melanogaster — ещё один важный организм, нейроанатомия которого была изучена с помощью многофотонной микроскопии. Сфокусированная визуализация обыкновенной плодовой мушки позволила получить ряд сведений о функционировании обонятельной системы, нейроактивности и отслеживании нейронов. Эта область неврологии фокусируется на влиянии, которое различные нейронные популяции оказывают друг на друга, и на функциональных связях между анатомическими областями мозга. Кроме того, плодовая мушка использовалась в качестве модели при изучении нейродегенеративных заболеваний, учитывая, что более половины генов, связанных с нейродегенерацией в мозге дрозофилы, имеют аналоги в головном мозге мыши или человека [5]. Плодовая мушка также обладает рядом практических преимуществ, включая её небольшой размер, стремительный цикл генерации и способность производить большое количество генетически модифицируемых личинок [6].
Обонятельная система Drosophila melanogaster позволяет ей распознавать сотни различных запахов. У этих насекомых обоняние играет решающую роль в поиске укрытий и пищи, а также в ходе спаривания. Нейроны обонятельных рецепторов обнаруживают и передают химические сигналы в центральную нервную систему. Этот процесс происходит в первичных органах обоняния плодовой мушки (антеннах) и верхнечелюстных щупальцах. На поверхности этих органов находятся сенсорные волоски, называемые сенсиллами, которые соединены с дендритами нейронов обонятельных рецепторов и покрыты сенсиллярной лимфой — прозрачной жидкостью, содержащей несколько типов белков, связывающих запахи [7].
Целью исследования этой сети нейронных популяций является изучение взаимосвязи между восприятием запаха и поведением. В одном исследовании, проведенном группой учёных Стэнфордского университета (Stanford University), антенны плодовой мушки были окрашены, чтобы визуализировать нейроны и сравнить развитие обонятельной нервной цепи ex vivo с условиями образца in vivo, используя замедленную визуализацию клеток. Один из выводов, сделанных в ходе исследования, заключался в том, что обонятельный контур в культуре экспланта развивается аналогично тому, как это происходит in vivo, но более медленными темпами [8]. Применение двухфотонной микроскопии позволило исследователям различать разные нейронные популяции всего мозга и одновременно отслеживать их активность в 3D.
Весь мозг дрозофилы был подвергнут резекции, а ядра клеток окрашены DAPI (4′,6-диамидино-2-фенилиндолом). Плодовая мушка была генетически модифицирована для экспрессии различных флуорофоров, что позволило легче дифференцировать нейронные популяции. Наложение этих окрашенных клеток показано на Рисунке 5, в то время как Рисунок 6 служит его ортогональным аналогом, что позволяет получить полную 3D-визуализацию мозга во всех плоскостях. Нервная система представляет собой сложную сеть различных клеток, работающих совместно друг с другом. Одновременная визуализация различных нейронных клеток в их 3D-среде позволяет увидеть, как они взаимодействуют друг с другом или с окружающей средой.
Нейробиологи видят важность изучения всего мозга, а не только отдельных областей. Однако можно было бы показать, что даже в состоянии покоя многие области мозга дрозофилы одновременно активны. Например, Максвелл Х. Тёрнер (Maxwell H. Turner) и его коллеги показали, что несколько нейронов в одной области могут оказывать влияние на другую область [9]. В целом, плодовая мушка поддерживает хорошую сохранность нервных сигнальных путей и общих клеточных процессов, и значит, исследуя этот организм, можно многому научиться. Способность дрозофилы сохранять нервные пути и клеточные процессы позволила биомедицине не только визуализировать анатомию плодовой мушки, но и оценить воздействие определённых методов лечения и лекарств без риска или этических последствий тестирования на людях. Для такого типа оценки важно иметь возможность визуализировать весь мозг во всей его глубине.
Масштабы использования лазерной сканирующей многофотонной микроскопии в клинических и биологических исследованиях быстро растут благодаря её преимуществам по сравнению с традиционной оптической визуализацией. Этот инструмент помог углубить понимание различных заболеваний, функциональности нейронов и структурных взаимосвязей, а также процессов развития. До сих пор ограничения, накладываемые на традиционный инструментарий, замедляли прогресс в основных исследованиях и промышленном применении. Однако следующее поколение систем многофотонной микроскопии будет способно произвести революцию в биомедицинских исследованиях и преодолеть традиционные барьеры, ограничивающие доступ к визуализации глубоких тканей. Будущие разработки и усовершенствования данной платформы включают дополнительные методы, такие как трёхфотонная и флуоресцентная живая визуализация, улучшенные оптические характеристики с использованием адаптивных методов, а также более быстрый и интеллектуальный рабочий процесс визуализации. И эти системы вполне могли бы осуществить все эти улучшения, сохраняя прежние физическую форму, эффективность и гибкость.
Вам может быть интересно:
Литература
1. M.E. Holmes et al. (2022). Next-generation laser scanning multiphoton microscopes are turnkey, portable, and industry-ready. Microsc Today, Vol. 30, No. 3, pp. 16—23, www.doi.org/10.1017/s1551929522000657.
2. K. Howe et al. (2013). The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature, Vol. 496, No. 7446, pp. 498—503, www.doi.org/10.1038/nature12111.
3. L.C. Leung et al. (2013). Imaging zebrafish neural circuitry from whole brain to synapse. Front Neural Circuits, Vol. 7, www.doi.org/10.3389/fncir.2013.00076.
4. S. Niklaus and S.C.F. Neuhauss (2017). Genetic approaches to retinal research in zebrafish. J Neurogenetics, Vol. 31, No. 3, pp. 70—87, www.doi.org/10.1080/01677063.2017.1343316.
5. D. Lessing and N.M. Bonini (2009). Maintaining the brain: insight into human neurodegeneration from Drosophila melanogaster mutants. Nat Rev Genet, Vol. 10, No. 6, pp. 359—370, www.doi.org/10.1038/nrg2563.
6. N. Tolwinski (2017). Introduction: Drosophila — a model system for developmental biology. J Dev Biol, Vol. 5, No. 3, p. 9, www.doi.org/10.3390%2fjdb5030009.
7. L.B. Vosshall (2000). Olfaction in Drosophila. Current Opin Neurobiol, Vol. 10, No. 4, pp. 498—503, www.doi.org/10.1016/S0959-4388(00)00111-2.
8. T. Li et al. (2021). Cellular bases of olfactory circuit assembly revealed by systematic time-lapse imaging. Cell, Vol. 184, No. 20, pp. 5107—5121, www.doi.org/ 10.1016/j.cell.2021.08.030.
9. M.H. Turner et al. (2021). The connectome predicts resting-state functional connectivity across the Drosophila brain. Curr Biol, Vol. 31, No. 11, pp. 2386—2394, www.doi.org/10.1016/j.cub.2021.03.004.
