Группа учёных из Института трансформирующих биомолекул Нагойского университета (яп. 名古屋大学) разработала молекулярный маркер, который позволяет решить проблему фотообесцвечивания в STED-микроскопии. Теперь биологи смогут понаблюдать за живыми митохондриями в беспрецедентном качестве, и, возможно, лучше понять, как устроены митохондриальные заболевания.
Дизайн нового молекулярного маркера MitoPB Yellow основывается на структурно усиленном нафтофосфольном флюорофоре, связанном с дифениламиновой группой. При введении маркер поглощается внутренней мембраной митохондрий, в том числе их складками — кристами. MitoPB Yellow показал хорошую устойчивость к воздействию лазера в процессе STED-микроскопии..
По словам исследователей, существовавшие до сих пор молекулярные маркеры быстро поддаются фотообесцвечиванию — под воздействием STED-лучей они быстро перестают флуоресцировать. Поэтому до этого практически невозможно было получить покадровую последовательность качественных изображений митохондрий за хоть какой-то более или менее продолжительный отрезок времени. Кроме того, повреждённые молекулярные маркеры могли в процессе становиться токсичными для клеток.
Для тестирования нового молекулярного маркера митохондрии были помещены в условия, в которых у них происходят структурные изменения, а именно, когда кристы митохондрий удлиняются при голодании клетки. До сих пор то, что такие изменения происходят, можно было наблюдать только с помощью просвечивающей электронной микроскопии. Но этот метод нельзя использовать на живых клетках, то есть, нельзя посмотреть на процессы в динамике.
В данном случае биологи поместили клетки в состояние голодания и использовали STED-микроскопы, чтобы понаблюдать их через три часа и через 12 часов. В процессе наблюдения микроскопы делали по изображению с разрешением 60 нм с определённой периодичностью. По словам исследователей, митохондрии впервые так продолжительно (до 600 изображений на 7 минут) наблюдались с таким разрешением.
Команда обнаружила, что за время наблюдения внутренняя структура митохондрий резко изменилась. Две кристы могли слиться в одну; во взаимодействие вошли соседствующие митохондрии — их внутренние мембраны могли сливаться в одну. Стало больше удлинённых крист. По мнению исследователей, увеличение и удлинение крист помогает повысить «эффективность производства энергии (синтеза АТФ), одновременно защищая митохондрии от запуска апоптоза — запрограммированной смерти клетки.
Но если период активного наблюдения длился более 90 секунд и при этом происходило воздействие лучей такой же интенсивности, внутренние мембраны некоторых митохондрий раскалывались на глобулы, которые разбухали и теряли кристы. Некоторые глобулы полностью разрывались, другие принимали сферическую форму. Исследователи отметили, что кристы и мембраны оставались чёткими на изображении в течение наблюдения, что указывает на то, что причиной смерти митохондрий была не токсичность деградирующего под светом лазера молекулярного маркера; митохондрии мог повредить чрезвычайно мощный лазер при STED-микроскопии. Запись наблюдения можно посмотреть на видео ниже.
Команда планирует продолжить исследования в этой области.
