Учёные из Калифорнийского университета в Дейвисе (UC Davis) на протяжении нескольких лет редактировали ген эмбрионов крупного рогатого скота, определяющий пол. В апреле появился бычок Космо (Cosmo) — и его ДНК демонстрирует перспективы данной области исследований.
Телёнок запоздал. Его ждали 30 марта, но не дождались. Поначалу зоогенетик Элисон ван Эненнам (Alison Van Eenennaam) объясняла задержку спецификой бычков: они норовят родиться на день-два позже нормального срока. Шли дни, и ван Эненнам нашла другое объяснение: эмбрионы с отредактированными генами — вроде того, который девять месяцев назад начал своё развитие в утробе Коровы 3113, — могут несколько запаздывать с подачей сигнала суррогатным матерям о своей готовности к родам. Но минула неделя, и после двух ложных тревог в университетском коровнике ван Эненнам, вся на нервах из-за отсутствия признаков приближающегося отёла, решила, что с неё хватит. Она позвонила ветеринару. Пришло время стимулировать роды.
В интересах развития мясной промышленности ван Эненнам с помощью технологии CRISPR стремилась впервые в мире создать линию крупного рогатого скота, и теперь успех всей этой почти пятилетней работы, стоившей более полумиллиона долларов, после десятков неудачных беременностей и бесчисленных научных неудач зависел от одного-единственного телёнка, которому, судя по всему, предстояло родиться в разгар пандемии.
Всего несколько недель назад губернатор Калифорнии во избежание распространения нового смертельно опасного коронавируса приказал всем жителям штата оставаться дома. Это произошло после того, как в США был выявлен первый больной с COVID-19. Больного поместили в медицинский центр Калифорнийского университета в Дейвисе, примерно в 20 милях от университетского коровника. В реанимационных отделениях больниц в районе залива Сан-Франциско не осталось свободных мест. Ван Эненнам беспокоило то, что коровьи роды могут осложниться и потребуется кесарево сечение, тогда как ветеринаров обязали беречь седативные средства ввиду растущего спроса на эти препараты при лечении людей с помощью ИВЛ от COVID-19. А тут ещё, будто мало было этой напасти, ветеринарный врач, прибывший в тот день наблюдать за родами, всё утро усыплял овец из университетского стада, которых ночью покалечили койоты.
«В свете того, как шла реализация этого проекта, иного и не следовало ожидать, — говорит ван Эненнам, и приятные австралийские нотки её голоса окрашены нервным сарказмом. — Было похоже на то, что прямо к нашему телёнку скачут три всадника Апокалипсиса».
Но получилось не совсем так. В тот день телёнок всё же родился: весом 110 фунтов, вороной — за исключением белых пятен над его задними копытцами. Двум ветеринарам пришлось цепями вытягивать его из Коровы 3113, но, когда его положили на подстилку из соломы, он был жив и здоров. «Кооооосмооо! — торжествующе воскликнула ван Эненнам. — Добро пожаловать в мир, малыш!»
Небо не померкло и конец света не наступил. Однако этот большой, сильный и здоровый вороной бычок всё же не был точно таким телёнком, какого надеялись получить учёные. Внимательное исследование его ДНК покажет, насколько непредсказуемым может быть редактирование генов с помощью CRISPR и как много ещё нужно узнать, прежде чем эта технология станет повседневным инструментом животновода.
Джоуи Оуэн (Joey Owen) никогда не был зоологом. Он изучал биохимию, а затем генетику онкологических заболеваний, прежде чем в 2014 году очутился в животноводческой лаборатории ван Эненнам. Для таких учёных, как они, то было время больших надежд. Всего двумя годами ранее в генной инженерии появилась перспективная технология CRISPR. Она открыла возможность внедрять в животноводство дизайнерские новшества, не прибегая к переносу генов животных одного вида другому. В основе старых генно-инженерных технологий лежит перемещение ДНК с помощью вирусов и бактерий, которое запускает дорогостоящий и длительный процесс одобрения со стороны регуляторных органов США. В результате, американские фермеры и владельцы ранчо, чтобы улучшить гены своих стад и отар, привыкли полагаться лишь на медленный и трудоёмкий прогресс селекционного разведения. Технология CRISPR обещала совершить революцию.
Ван Эненнам вознамерилась улучшить крупный рогатый скот, используя ген SRY — длинный участок Y-хромосомы, который диктует эмбрионам млекопитающих развитие мужских черт. В естественных условиях рождение у коров потомства разного пола — мужского (XY) или женского (XX) — равновероятно (это справедливо и для людей). Ван Эненнам надеялась получить возможность создавать стада, состоящие из одних самцов, добавляя с помощью CRISPR ген SRY в Х-хромосому эмбрионов крупного рогатого скота. Любые животные с геном SRY, даже генетические самки (с двумя X-хромосомами), физиологически были бы самцами. Получится или не получится, ван Эненнам не знала, ибо до неё этого никто не делал, но она твёрдо решила проверить гипотезу, каким бы ни оказался итог.
Мясной промышленности нужен крупный рогатый скот помассивнее и помясистее, поэтому чем больше самцов — тем лучше, тем больше прибыль. Поскольку быки набирают вес лучше, чем коровы, выращивание одних быков позволит фермерам, имея меньшее поголовье скота, производить такое же количество мяса, как и прежде, и при этом уменьшить животноводческие выбросы в атмосферу парниковых газов. Ван Эненнам мечтала о том, что её гипотеза в случае своего подтверждения откроет путь для создания не только разнообразного однополого поголовья (куриных стай из одних лишь кур-несушек, коровьих стад из одних молочных коров и т. д.), но и, в конечном счёте, менее грубой системы промышленного производства продуктов питания.
Однако экспериментальное исследование, которое она и Оуэн предложили министерству сельского хозяйства США (МСХ США), было невероятно амбициозным. Оно требовало вводить очень большой фрагмент ДНК в эмбрионы крупного рогатого скота. На тот момент, когда исследователи подали в МСХ заявку на получение гранта с оценкой биотехнологического риска, схожее редактирование с помощью CRISPR было проведено только дважды, да и то не в эмбрионах, а в коровьих клетках. Тем не менее, министерство предоставило ван Эненнам и Оуэну пятилетний грант на сумму 500 000 долларов. «Когда МСХ США профинансировало наш проект, нам долго не верилось», — вспоминает Оуэн. И с самого начала исследование пошло не так, как планировалось.
На первом этапе исследователи попытались, используя CRISPR, внести нужные им изменения в эмбрионы крупного рогатого скота. По сути, технология CRISPR — это программируемый молекулярный скальпель. Нацелившись на определённый участок генома, он разрезает основную цепь двойной спирали ДНК. Затем вступает в дело клеточная система репарации, задача которой сшить разрезанную ДНК. Когда хотят добавить в место разреза новые фрагменты генетического кода, хитрость состоит в том, чтобы подсунуть клетке вместе с компонентами CRISPR нужный «образец для починки ДНК» — в данном случае копию гена SRY.
Эта технология лучше всего работает в клетках, которые активно делятся. А вот в одноклеточных эмбрионах, как вскоре обнаружил Оуэн, использовать её тяжело. «Чего мы только не пробовали, — говорит он, — но ничего не получилось».
Исследователям пришлось прибегнуть к более старому и менее предпочтительному методу: редактировать клетки быка и затем клонировать их ДНК в яйцеклетки. (Примерно в то же время китайская исследовательская группа успешно использовала эту технологию для того, чтобы с помощью CRISPR снабдить крупный рогатый скот геном устойчивости к туберкулёзу). Стремясь облегчить данный процесс, Оуэн добавил к гену SRY ген GFP (зелёного флуоресцентного белка). Эта добавка дала возможность видеть клетки с успешно вставленной в Х-хромосому генетической программой мужского развития. И вскоре учёный заметил странное: все светящиеся клетки, то есть клетки с успешно отредактированной ДНК, перестали делиться. Проведённая редакция остановила их развитие.
Когда команда Оуэна начинала эксперимент, исследователи нацелились на участок Х-хромосомы, который, как они думали, находился в зоне «мусорной ДНК», вдали от всех жизненно важных генов. Но единственной картой генома крупного рогатого скота, которой они в то время располагали, был грубый портрет, созданный более десяти лет ранее. Когда весной 2018 года вышел в свет обновлённый геном крупного рогатого скота, выяснилось, что в ходе эксперимента ген SRY был вставлен не туда, куда следовало: расстояние от этого гена до гена, необходимого для роста клеток, оказалось вдвое меньше, чем 10 000 пар оснований.
Исследователи вернулись к исходному пункту и, чтобы никакие жизненно важные гены не влияли на редактирование, перепроектировали свою систему CRISPR, используя обновлённую карту. Затем они заново провели эксперимент с эмбрионами. На этот раз получилось удачно. Однако это случилось летом 2018 года, то есть прошло почти три года. Реализация проекта выбилась из графика. Исследователям пришлось попросить МСХ США продлить действие их гранта. Из-за долгой череды неудач Оуэн пребывал в крайне подавленном состоянии и жалел, что взялся за CRISPR-эксперименты с крупным рогатым скотом. Его успех с редактированием генома эмбрионов в новом месте Х-хромосомы приободрил его, но ненадолго. Эмбрионы первой партии, отредактированные и помещённые в матку тёлок, призванных сыграть роль суррогатных матерей, зачахли. Пять имплантированных эмбрионов из следующей партии вышли на уровень ранней стадии беременности, но через несколько недель и они пропали.
Чтобы установить причину неудач, Оуэн и ван Эненнам проконсультировались с заводчиками и ветеринарами. Те предположили, что исследователи повредили эмбрионы — возможно, во время биопсии, когда от эмбриона отделяют крохотный кусочек, чтобы провести секвенирование и определить, насколько удачным оказалось редактирование. Всё это требует времени, и, кроме того, пока лаборатория секвенирования не получит результаты, эмбрионы должны пребывать в замороженном виде. Каждый шаг — замораживание, биопсия, редактирование — снижает жизнеспособность эмбрионов.
Можно было действовать и проще: снова добавить ген, вызывающий флуоресцентное свечение, а потом осветить эмбрионы вспышкой ультрафиолетового излучения. Зелёное свечение сообщило бы о том, что редактирование прошло удачно, а значит, биопсия или заморозка не требуются. Но, поскольку GFP получают с помощью гена одного из видов биолюминесцентных медуз (тех, что обитают в прибрежных водах штата Вашингтон), создаваемые исследователями животные оказались бы генетически модифицированными организмами, или ГМО, а в этом случае заручиться поддержкой МСХ было бы очень трудно. Весь смысл проекта и использования CRISPR состоял в том, чтобы избежать создания ГМО.
Однако, пока исследователи пытались как-то преодолеть возникшее затруднение, нормативно-правовая база изменилась. В январе 2017 года FDA решило рассматривать любую отредактированную ДНК животных как новое лечебное средство. Для любого CRISPR-стада, состоящего исключительно из самцов, это означало, что к нему будут применять те же правила, какие установлены для ГМО первого поколения. И если, решила команда, редактировать ДНК коровы — это, как считают министерские чиновники, всё равно, что добавлять ген медузы, почему бы не облегчить себе задачу? Чтобы не связываться с этими чиновниками, животноводы или коммерческие организации скорее всего предпочтут игнорировать эксперименты с геном SRY, а раз так, то можно, не стесняясь, продолжить работу с геном GFP.
В последний раз ван Эненнам и Оуэн попытались вставить ген SRY вместе с геном GFP в геномы двухсот эмбрионов. Поскольку это была последняя попытка, исследователи решили вносить поправку не в Х-хромосому, как ранее, а в 17-ю хромосому — в её сайт, известный как «тихая гавань». В ходе этого эксперимента, говорит Оуэн, выжило двадцать два эмбриона, девять из них мерцали в ультрафиолетовом свете, но только один был целиком ярко-зелёным. И через месяц после переноса всех эмбрионов в матки тёлок только ярко-зелёный стал расти. Исследовательская группа решила назвать этого растущего телёнка Космо в честь светящегося зелёного персонажа из мультсериала середины 2000-х годов «Волшебные покровители» («The Fairly OddParents») телеканала Nickelodeon. «Я явно отстала от жизни, потому что никогда не слышала об этом сериале», — говорит ван Эненнам.
УЗИ показало, что Космо будет самцом. И 7 апреля, когда он родился, первое, что проверил ветеринар, — дышит ли этот малыш, а второе — действительно ли он самец. «Ага, у него яички — две штуки! — сообщил врач ван Эненнам и Оуэну. — Фенотипический самец. Хороший старт!»
Но, чтобы узнать, приобрёл ли Космо мужские достоинства благодаря CRISPR, нужно было взглянуть на его ДНК. Из шеи телёнка взяли на анализ кровь. Едва кровь оказалась в пробирках, Оуэн побежал с ними в лабораторию, где поместил их в холодильник для 16-часового охлаждения. Придя домой, он выпил несколько бутылок пива, чтобы унять охватившее его нетерпение, и поставил будильник на 6:30 следующего утра. Оуэн проснулся в 5 часов и, хотя было ещё темно, поспешил в лабораторию. Проведя экстракцию ДНК из крови телёнка, он применил гель-электрофорез продуктов ПЦР, чтобы выявить присутствие добавленных генов SRY и GFP. Примерно через четыре часа, обнаружив эти гены именно там, где и ожидалось, он ошалел от восторга. «Чёрт возьми, ты и впрямь сделал это!» — пронеслось у него в голове.
Рядом с ним были лишь безмолвные инструменты. В лаборатории из-за пандемии не могло быть более одного человека; коллеги Оуэна сидели дома. Поэтому он сделал снимок геля и отправил его по электронной почте всем членам команды.
Когда это электронное письмо пришло к ван Эненнам, она находилась в своей спальне, одновременно служившей кабинетом, и была готова к тому, что новость будет плохой. Но вместо печали её охватила буйная радость. «Ессть!» — воскликнула она, сотрясая воздух кулаками.
Полного триумфа не получилось. Как установили исследователи, Космо имел пару хромосом XY, то есть был бы самцом даже без редактирования его генома, ибо унаследовал ген SRY от своего биологического отца. Однако благодаря вставке, произведённой Оуэном, этот ген оказался и в его 17-й хромосоме, а значит, эксперимент удался: впервые в мире технология CRISPR успешно сработала в эмбрионе крупного рогатого скота. «Это реально круто — получить такой результат, — убеждена ван Эненнам. — Этот день войдёт в историю науки как один из лучших».
Но это не всё, что удалось выяснить уже при первом, быстром сканировании ДНК Космо. Ещё был обнаружен фрагмент генетического кода не коровы или медузы, а бактерии. Чтобы вставить большой ген — а длина гена SRY составляет несколько тысяч букв ДНК — в одноклеточный эмбрион Космо, Оуэну пришлось доставить его в клетку единственным возможным в то время способом: поместив его в плазмиду — круглый фрагмент бактериальной ДНК. После того, как технология CRISPR сделала свои разрезы, ферменты репарации ДНК Космо захватили плазмиду вместе с геном SRY и вставили всё это в геном.
Такая погрешность случалась и прежде. В прошлом году подобную плазмиду обнаружили в паре комолых (безрогих) быков, генетически созданных учёными биотехнологической компании Recombinetics со штаб-квартирой в Миннесоте. Комолые быки создавались путём редактирования и клонирования клеток с последующим помещением в матку коровы. Ван Эненнам получила от МСХ США деньги на обследование быков Recombinetics и их потомков с целью выяснить, наследуются ли внесённые генетические изменения надлежащим образом. Плазмиду обнаружил специалист МСХ, анализировавший результаты секвенирования ДНК некоторых из этих потомков, после того как ван Эненнам обратилась в министерство с просьбой предоставить Калифорнийскому университету в Дейвисе льготу, дающую возможность забивать и продавать на месте быков, выращенных в университетском коровнике.
Учёные из Recombinetics никогда не заморачивались проверкой на присутствие плазмиды. Хотя установлено, что такая бактериальная ДНК не оказывает на животных или их мясо никакого вредного воздействия, во многих странах животные с плазмидой в ДНК считаются ГМО, что означает более строгий нормативный контроль. Компания планировала, используя сперму своих быков, вырастить в Бразилии целое стадо, но обнаружение плазмиды разрушило этот план. Небольшая, но растущая отрасль животноводства, созданная на основе редактирования скота, получила тяжёлый удар.
Зато благодаря этой неудаче учёным стало понятнее, какие проблемы могут встретиться на их пути. Учитывая печальный опыт Recombinetics, команда ван Эненнам заранее запланировала тщательное исследование ДНК Космо. И в это дело весьма некстати вмешалась пандемия. Университетский центр секвенирования был закрыт. Поэтому команда, чтобы выяснить, что генетически представляет собой Космо, отправила образцы его крови, тканей и плаценты в лаборатории двух разных компаний. Полученный результат оказался более странным, чем ожидали ван Эненнам и её коллеги.
Технология CRISPR сделала вставки, которые и должна была сделать. Но не только это. В результате на том участке, где ван Эненнам и Оуэн планировали вставить лишь пару генов (гены SRY и GFP), картина оказалась гораздо более сложной и запутанной. На одном плече 17-й хромосомы запланированное изменение структуры ДНК вообще не получилось. Клетка ликвидировала разрыв с помощью случайно образовавшейся последовательности из 26 «букв» ДНК. (Устранять разрывы двухцепочечной ДНК таким путём вполне нормально для клетки). Существенную роль сыграли изменения, которым подверглось другое плечо. Примерно в 90 процентах клеток было выявлено семь копий генов SRY и GFP. Две из них оказались вставленными задом наперёд. А ещё там присутствовала бактериальная плазмида. Примерно в 10 процентах клеток учёные обнаружили три (должным образом ориентированных) копии конструкции SRY-GFP и одну плазмиду.
Важно не то, куда попали копии гена SRY, а то, что их оказалось много. Вдобавок, в Y-хромосоме обнаружили копию этого гена, унаследованную Космо от его отца. «Он очень мужественный мужчина», — шутит ван Эненнам. Эти множественные вставки не планировались, отмечает она, но пока они, по-видимому, не причиняют Космо никакого вреда. «Факт его существования свидетельствует о том, что наличие в его организме большего, чем необходимо, количества копий гена SRY, не является смертельным», — говорит ван Эненнам.
Эксперименты с мышами, в ДНК которых вставляли добавочные копии гена SRY, не дали никаких фактов, говорящих о вредности таких мутаций для здоровья, разве что у самок (XX-особей) они способны вызывать бесплодие. Как бы то ни было, скопление копий гена SRY, образовавшееся в ДНК Космо, относится к тем непредвиденным результатам редактирования генов с помощью CRISPR, на которые ссылаются критики этой технологии, подчёркивая её опасность. В последние годы другие проведённые за рубежом исследования, направленные на создание дизайнерских сельскохозяйственных животных для рынка, выявили странные побочные эффекты, например увеличение кроличьих языков, появление у свиней лишних позвонков и преждевременную гибель крупного рогатого скота. Лайза Мозес (Lisa Moses), специалист по биоэтике животных Гарвардской медицинской школы (Harvard Medical School), комментируя сообщения об этих странных эффектах для The Wall Street Journal, сказала так: «Это не что иное, как высокомерие — заявлять, будто мы знаем, что делаем, и способны предсказывать, какие неприятности могут произойти».
По мнению Фёдора Урнова, специалиста по редактированию генов Института инновационной геномики Калифорнийского университета в Беркли (UC Berkeley’s Innovative Genomics Institute), не принимавшего участия в работе команды Калифорнийского университета в Дейвисе, наивно ожидать, что новаторские исследования, подобные эксперименту ван Эненнам и её коллег, сразу же окажутся безупречными. «Они попытались создать быка путём целенаправленной интеграции, используя редактирование генов эмбриона, и, фактически, эта попытка удалась», — говорит он. Было ли редактирование чистым? Нет. Значит ли это, что данное направление исследований бесперспективно? Абсолютно не значит, считает он. «Есть способы преодолеть эти проблемы, но нельзя сделать это, не узнав об их наличии».
Потребуются годы тщательного изучения, чтобы точно выяснить, как влияет на Космо множество копий гена SRY. А пока команда Калифорнийского университета в Дейвисе обнародовала в четверг утром исходный анализ генома Космо на постерной презентации Американского общества наук о животных (American Society of Animal Science). Гаэтан Бурджио (Gaétan Burgio), генетик Австралийского национального университета в Канберре (Australian National University in Canberra), изучивший эти результаты, говорит, что он не удивлён тем, что они неидеальны. Для его группы обычное дело — создавать новые модели для исследования человеческих болезней, добавляя с помощью CRISPR новые гены в ДНК мышей. Многократное копирование и нежелательные вставки плазмиды весьма типичны, утверждает австралийский генетик. «Мы то и дело видим это, проводя опыты с мышами», — говорит он. Иногда клетки включают в свой состав по нескольку копий бактериальной ДНК. Бурджио сталкивался с тем, что на одно животное приходилось до 70 штук. «Это абсолютный кошмар — делать вставки с использованием CRISPR», — заявляет он.
В этом хаосе повинна кинетика ферментов редактирования генов, утверждает учёный. Даже стараясь очень аккуратно разрезать ДНК на две части, трудно получить запланированный результат. Но учёные ещё не знали об этом в ранний период редактирования генов с помощью CRISPR, а именно в этот период ван Эненнам приступила к реализации проекта по выращиванию самцов крупного рогатого скота. По словам Бурджио, примерно до конца 2017 года не появлялось никаких сообщений о том, что при редактировании мышиных генов бывают ошибочные вставки и другие нежелательные эффекты.
В некоторых более новых версиях технологии CRISPR таких ошибок удаётся избегать за счёт того, что ДНК лишь надрезается. Это снижает вероятность нежелательных вставок. Однако такие системы зачастую ущербны в других отношениях: они могут работать далеко не во всех клетках и способны производить другие виды незапланированных эффектов. «Суть в том, что идеального инструмента не существует», — говорит Бурджио. По его мнению, команда Калифорнийского университета в Дейвисе очень грамотно разработала дизайн эксперимента с крупным рогатым скотом и провела анализ его результатов. Тем не менее, проделанная ею работа — ещё одно доказательство того, что перестройка ДНК домашнего скота с использованием CRISPR всё ещё очень молодая отрасль науки. «Уже сейчас мы умеем эффективно редактировать гены животных, но пока не научились делать это безопасно. Я думаю, научимся. Однако впереди ещё очень много работы», — говорит учёный.
Для ван Эненнам часть этой работы — выращивание Космо до репродуктивной зрелости и сбор его спермы весной будущего года, чтобы попробовать вырастить следующее поколение телят. Теоретически, бычки должны составить 75 процентов потомства Космо — 50 процентов нормального потомства, которое унаследует его Y-хромосому, и ещё 25 процентов потомства, которое получит от Космо гены SRY, вставленные в его 17-ю хромосому с помощью CRISPR. Ван Эненнам надеется узнать, достаточно ли этих копий для запуска программы развития, вынуждающей генетических самок выглядеть и развиваться (в частности, прибавлять в весе), как самцы. Для проведения новых экспериментов ван Эненнам нужно подать заявку на новый грант.
Всё её исследование будет чисто научным; это стало ясно, когда пришлось задействовать гены медузы, то есть ещё до того, как в ДНК Космо была обнаружена плазмида. Ни Космо, ни его потомство никогда не будут использованы в качестве еды. Их история, вероятно, закончится в университетском крематории.
Если следующий этап окажется неудачным, это может стать концом попытки ван Эненнам создать стадо, состоящее из одних быков. «Поскольку делать вставки очень тяжело, я не уверена, что снова возьмусь за этот проект», — говорит она.
Однако это не значит, что её усилия не помогут данной сфере исследований выйти на новый уровень. В Австралии с помощью CRISPR исследователи определяют пол цыплёнка, причём определяют прямо в тот день, когда отложено яйцо, из которого он должен вылупиться. Благодаря этому яйца с эмбрионами самцов можно уничтожить до того, как они превратятся в чувствующих, пищащих цыплят. В Германии исследователи используют CRISPR для такого редактирования спермы хряков (самцов свиней), которое делает всё их потомство состоящим из одних самок. Дело в том, что в мясе выросших самцов присутствует портящий аппетит химический коктейль, называемый «запахом хряка». Сегодня фермеры нередко пытаются избежать возникновения запаха хряка, кастрируя без анестезии самцов-подростков, но в Германии эту жестокую практику недавно запретили. (Соответствующий закон вступает в силу в следующем году). И в других странах реализуются десятки разнообразных проектов, предусматривающих использование CRISPR для того, чтобы животные, которых выращивают животноводы, меньше страдали от болезней и разных форм жестокого обращения. Космо есть чему научить исследователей из самых разных уголков мира.